Né en 1971 à Los Angeles, Nicholas Brendon est le frère jumeau de l’acteur Kelly Donovan.
Moqué par ses camarades de classe pour son bégaiement, il rêve à l’époque d’une carrière sportive au sein de l’équipe de base-ball des Dodgers de Los Angeles. Un an après le lycée, il se blesse gravement et doit renoncer à ses ambitions professionnelles.
Il se tourne vers la comédie et joue dans plusieurs publicités avant d’enchaîner les petits boulots pour subvenir à ses besoins. Il décroche finalement le rôle de Xander Harris dans la série télévisée américaine Buffy contre les vampires. Diffusée à partir de 1997 et jusqu’en 2003, cette série est un énorme succès et fait de Xander un personnage culte des années 90.
Au cinéma, il obtient son premier grand rôle en 2000, dans le long-métrage Phycho Beach Party de Charles Busch. Après l’arrêt de Buffy contre les vampires, Nicholas Brendon joue dans plusieurs films et séries télévisées qui passent relativement inaperçus.
En août 2022, il est hospitalisé d'urgence suite à un incident cardiaque.
En 2001, il se marie avec l’actrice Tressa DiFiglia qui apparaît dans les séries Urgences et New Girl et de qui il divorce en 2006. En octobre 2014, il se marie pour la seconde fois, cette fois avec la comédienne Moonda Tee.
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